IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) ni analogi ya substrate ya β-galactosidase, ambayo inaweza kufyonzwa sana. Chini ya uanzishaji wa IPTG, kichocheo kinaweza kuunda mchanganyiko na protini ya kukandamiza, Ili muundo wa protini ya kukandamiza ubadilishwe, ili isiweze kuunganishwa na jeni lengwa, na jeni lengwa lionyeshwe kwa ufanisi. Kwa hivyo mkusanyiko wa IPTG unapaswa kuamuliwaje wakati wa jaribio? Je, kubwa zaidi ndiyo bora zaidi?
Kwanza, hebu tuelewe kanuni ya uanzishaji wa IPTG: Lactose operon (kipengele) cha E. coli kina jeni tatu za kimuundo, Z, Y, na A, ambazo huweka β-galactosidase, permease, na acetyltransferase, mtawalia. lacZ huhidrolisisi lactose kuwa glukosi na galactose, au ndani ya allo-lactose; lacY huruhusu lactose katika mazingira kupita kwenye utando wa seli na kuingia kwenye seli; lacA huhamisha kundi la asetili kutoka asetili-CoA hadi β-galactoside, ambayo inahusisha kuondoa Athari ya sumu. Zaidi ya hayo, kuna mfuatano wa uendeshaji O, mfuatano wa kuanzia P na jeni la udhibiti I. Msimbo wa jeni I ni protini ya kukandamiza ambayo inaweza kushikamana na nafasi ya O ya mfuatano wa opereta, ili operon (meta) ikandamizwe na kuzimwa. Pia kuna eneo la kufungamana kwa ajili ya tovuti ya kufungamana ya protini-CAP ya kichochezi cha jeni cha kataboliki juu ya mfuatano wa kuanzisha P. Mfuatano wa P, mfuatano wa O na eneo la kufungamana la CAP pamoja huunda eneo la udhibiti la operon ya lac. Jeni za usimbaji wa vimeng'enya hivyo vitatu hudhibitiwa na eneo moja la udhibiti ili kufikia usemi ulioratibiwa wa bidhaa za jeni.
Kwa kukosekana kwa lactose, lac operon (meta) iko katika hali ya ukandamizaji. Kwa wakati huu, kikandamizaji cha lac kinachoonyeshwa na mfuatano wa I chini ya udhibiti wa mfuatano wa kichocheo cha PI hufungamana na mfuatano wa O, ambao huzuia RNA polimerasi kufungamana na mfuatano wa P na kuzuia uanzishaji wa unukuzi; wakati lactose ipo, lac operon (meta) inaweza kusababishwa. Katika mfumo huu wa operon (meta), kichocheo halisi si lactose yenyewe. Lactose huingia kwenye seli na huchochewa na β-galactosidase ili kubadilishwa kuwa allolactose. Mwisho, kama molekuli ya kichocheo, hufungamana na protini ya kikandamizaji na hubadilisha umbo la protini, ambalo husababisha kutengana kwa protini ya kikandamizaji kutoka kwa mfuatano wa O na unukuzi. Isopropylthiogalactoside (IPTG) ina athari sawa na allolactose. Ni kichocheo chenye nguvu sana, ambacho hakijachanganuliwa na bakteria na ni thabiti sana, kwa hivyo hutumika sana katika maabara.
Jinsi ya kubaini kiwango bora cha IPTG? Chukua E. coli kama mfano.
Aina ya E. coli BL21 iliyobadilishwa vinasaba yenye pGEX chanya inayoweza kuunganishwa tena (CGRP/msCT) ilichanjwa kwenye kinyesi cha LB kilicho na 50μg·mL-1 Amp, na kukuzwa usiku kucha kwa joto la 37°C. Kinyesi kilichotajwa hapo juu kilichanjwa kwenye chupa 10 za kinyesi cha LB 50mL kilicho na 50μg·mL-1 Amp kwa uwiano wa 1:100 kwa ajili ya kinyesi cha upanuzi, na wakati thamani ya OD600 ilikuwa 0.6~0.8, IPTG iliongezwa kwenye mkusanyiko wa mwisho. Ni 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Baada ya kuingizwa kwa joto sawa na wakati huo huo, mL 1 ya myeyusho wa bakteria ilichukuliwa kutoka humo, na seli za bakteria zilikusanywa kwa kutumia centrifugation na kufanyiwa SDS-PAGE ili kuchanganua ushawishi wa viwango tofauti vya IPTG kwenye usemi wa protini, na kisha kuchagua mkusanyiko wa IPTG wenye usemi mkubwa zaidi wa protini.
Baada ya majaribio, itagundulika kuwa mkusanyiko wa IPTG si mkubwa iwezekanavyo. Hii ni kwa sababu IPTG ina sumu fulani kwa bakteria. Kuzidi mkusanyiko pia kutaua seli; na kwa ujumla, tunatumaini kwamba protini inayoyeyuka zaidi inayoonyeshwa kwenye seli, ni bora zaidi, lakini katika hali nyingi wakati mkusanyiko wa IPTG ni mkubwa sana, kiasi kikubwa cha kuingizwa kitaundwa. Mwili, lakini kiasi cha protini inayoyeyuka kilipungua. Kwa hivyo, mkusanyiko unaofaa zaidi wa IPTG mara nyingi sio mkubwa zaidi, lakini kiwango cha chini cha mkusanyiko.
Madhumuni ya uanzishaji na ukuzaji wa aina zilizobadilishwa vinasaba ni kuongeza mavuno ya protini lengwa na kupunguza gharama. Usemi wa jeni lengwa hauathiriwi tu na vipengele vya aina yenyewe na plasmidi ya usemi, lakini pia na hali zingine za nje, kama vile mkusanyiko wa kichocheo, halijoto ya uanzishaji na muda wa uanzishaji. Kwa hivyo, kwa ujumla, kabla ya protini isiyojulikana kutolewa na kusafishwa, ni bora kusoma muda wa uanzishaji, halijoto na mkusanyiko wa IPTG ili kuchagua hali zinazofaa na kupata matokeo bora ya majaribio.
Muda wa chapisho: Desemba-31-2021